Ondes sonores pour résoudre le problème de la recristallisation en cryoconservation

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7603 (2023) Citer cet article

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La biobanque d'organes est le sujet en suspens de la cryoconservation. Bien que le problème soit multiforme, les progrès des dernières décennies l'ont largement lié à la réalisation d'un réchauffement rapide et uniforme des échantillons cryoconservés. Il s'agit d'un défi physique largement étudié dans le passé en plus des études de toxicité des cryoprotecteurs, qui ont également montré de grands progrès. Cet article présente une preuve de principe, basée sur le nématode Caenorhabditis elegans, d'une technologie capable de remplir une telle fonction : les ultrasons focalisés de haute intensité. Ainsi, évitant le problème de la recristallisation, ce ver, à l'état adulte, conservé à − \(80\;^\circ{\rm C}\), a été systématiquement ramené à la vie après avoir été chauffé aux Ultrasons Focalisés de Haute Intensité (HIFU) ondes. Le grand avantage de cette technologie est qu'elle est évolutive ; de plus, le réchauffement peut être suivi en temps réel par thermographie IRM et peut être contrôlé par interférométrie acoustique. Nous prévoyons que nos découvertes sont le point de départ d'une approche possible du réchauffement qui peut être utilisée pour la cryoconservation de systèmes à l'échelle millimétrique : soit seule, soit en combinaison avec d'autres méthodes de chauffage prometteuses, comme le nanoréchauffement ou le chauffage diélectrique, la technologie actuelle offre de nouvelles façons de résoudre les aspects physiques du problème de la recristallisation en cryoconservation, ouvrant la porte au stockage à long terme d'échantillons plus volumineux.

La conservation d'organes en banque à basse température offre d'innombrables opportunités1,2. Actuellement, cette possibilité est restée insaisissable, avec seulement quelques succès partiels et isolés, c'est-à-dire dans le rein de lapin, l'ovaire ou le foie de mouton3,4,5. Bien qu'il existe différentes stratégies de cryoconservation, pour le stockage cryogénique à long terme des organes, les dommages causés par l'apparition éventuelle de cristaux de glace sont en grande partie responsables de cette situation. Dans les paragraphes suivants, nous tenterons de replacer le problème dans le contexte général de la cryoconservation. Ensuite, nous comprendrons pourquoi un réchauffement rapide et uniforme parvient à éviter cela. Enfin, nous verrons comment les ultrasons focalisés de haute intensité peuvent offrir la solution.

Déjà en 1940 Luyeté comprenait bien que la vitrification des systèmes biologiques était possible simplement en traversant la zone où la glace pouvait apparaître à une vitesse suffisante. Ceci est représenté symboliquement sur la figure 1 : lorsque la température monte ou descend, on passe d'une phase à une autre ; cependant, nous pouvons sauter une certaine phase si le changement de température est assez rapide. Ainsi, on peut passer du liquide au verre, et inversement, sans passer par l'état cristallin ; pour cela, il suffit que le temps caractéristique de cette transition soit inférieur au temps caractéristique nécessaire à la nucléation et à la croissance de la glace.

Effets des vitesses de refroidissement et de réchauffement sur le changement de phase d'un système aqueux. L'axe horizontal représente la température en Kelvin, avec les températures de transition entre les quatre états (verre, cristal, liquide et gaz) étiquetées et Tglass (température de transition vitreuse), Tmelt (température de fusion) et Tboil (température de vaporisation). Cet axe peut être parcouru dans les deux sens, correspondant aux changements d'état lors du franchissement des températures repérées. L'axe vertical représente la vitesse à laquelle le changement de température se produit. L'arrangement des molécules du système pour les quatre états mentionnés est représenté de manière illustrative. Dans ce diagramme, la vitesse à laquelle il traverse les températures marquées est particulièrement intéressante, la plus pertinente pour le sujet qui nous concerne étant le passage de l'état liquide à l'état vitreux. Un changement de température trop lent (faibles valeurs sur l'axe vertical) pour passer de la phase liquide à la phase vitreuse, et vice versa, implique le passage nécessaire par la phase cristalline, ce qui dans les systèmes aqueux implique la formation de glace. Au lieu de cela, des taux de refroidissement et/ou de réchauffement élevés (valeurs élevées sur l'axe vertical) contournent la région "cristalline", donnant un changement direct entre les états liquide et vitreux.

Le problème rencontré par Luyet était que de tels taux de refroidissement et de réchauffement étaient souvent impossibles à atteindre dans des systèmes de plus de quelques dizaines de microns. Bien qu'il soit conscient que ces vitesses pouvaient être réduites avec l'ajout de solutés, il décide d'explorer une autre voie : celle d'essayer de les atteindre en améliorant le transfert de chaleur. Par conséquent, il n'a pu sauver qu'un petit nombre de minuscules systèmes biologiques grâce au processus.

Il a fallu attendre la découverte du glycérol7 pour que ces vitesses soient dans les limites de ce qui était techniquement faisable. Pour cela, la déshydratation produite par la glace extracellulaire est essentielle8,9. C'est la technique dite de congélation lente qui est actuellement utilisée dans des milliers de laboratoires.

Par la suite, l'apparition d'autres cryoprotecteurs a conduit au développement d'alternatives à la congélation lente. Ceux-ci n'ont pas besoin de glace extracellulaire pour réaliser la vitrification de l'intérieur de la cellule. Du fait de cette absence totale de glace, tant à l'intérieur qu'à l'extérieur des alvéoles, elles reçoivent le nom générique de techniques de vitrification. Dans ce cas, il est courant de faire la distinction entre vitrification à l'équilibre et hors équilibre, à savoir. Dans la vitrification à l'équilibre - après Farrant10 - des concentrations croissantes de cryoprotecteur sont ajoutées au système à mesure que sa température baisse, imitant ainsi, dans une certaine mesure, l'effet de la glace extracellulaire dans la congélation lente. Compte tenu de sa toxicité11,12, la quantité de cryoprotecteur pour chaque température est maintenue au minimum, juste assez pour éviter la formation de glace, en suivant le diagramme d'équilibre thermodynamique solide-liquide ; d'où son nom10,13,14,15. Au contraire, dans la technique dite de vitrification hors équilibre, tout le cryoprotecteur est ajouté dès le début, ou en un nombre réduit d'étapes, mais toujours, généralement, à des températures supérieures à zéro et à des concentrations capables d'atteindre la vitrification par simple immersion. l'échantillon dans l'azote liquide16,17. Évidemment, il existe des stratégies intermédiaires. Dans ceux-ci, la concentration de cryoprotecteur ne suit pas la ligne du diagramme de phase, mais reste dans la bande délimitée entre la possibilité de sous-refroidissement et la limite de toxicité3,18 ; ou on joue sur la compatibilité de la vie avec une apparition modérée de glace19,20. En résumé et en nous concentrant sur ce qui nous concerne ici : (1) les techniques de cryoconservation diffèrent fondamentalement les unes des autres par la quantité de cryoprotecteur dont dispose le système pour chaque température ; (2) ladite quantité de cryoprotecteur régit la position, la largeur et les vitesses auxquelles cette zone de la figure 1 doit être traversée dans les deux sens pour éviter la formation de glace21 ; et (3) dans tous les cas, cette quantité de cryoprotecteur est réduite au minimum compte tenu de sa toxicité. Avec tout cela, aujourd'hui, la problématique porte sur l'optimisation de trois facteurs : le transfert de masse, le transfert de chaleur et la toxicité des cryoprotecteurs. Et c'est là qu'interviennent fondamentalement la géométrie et les dimensions du système, et par conséquent, l'origine de la difficulté de la cryoconservation des organes : avec de petits systèmes, des vitesses de refroidissement/réchauffement très élevées peuvent être atteintes et ainsi il est possible de maintenir la concentration de cryoprotecteur bas22. Cependant, lorsque les systèmes sont grands, il est plus difficile d'atteindre cet équilibre entre toxicité et transfert de chaleur, de sorte que la glace apparaît fréquemment de manière létale, aussi bien dans ceux vitrifiés par congélation lente23 que par vitrification4,24, bien que généralement avec des paramètres très différents. valeurs, mais l'origine du problème est fondamentalement la même dans les deux cas.

Paradoxalement, il est plus facile d'éviter la formation de cristaux de glace létaux lors du refroidissement que lors du réchauffement21. L'origine de ce curieux comportement réside dans l'existence d'une double nécessité pour l'apparition desdits cristaux : celle de leur nucléation et celle de leur croissance. Parce que la croissance nécessite une faible viscosité, elle se produit préférentiellement à des températures élevées. Cependant, la nucléation est plus probable à des températures très basses, généralement proches de Tg (typiquement \(\sim -100 \; ^\circ{\rm C}\) pour les solutions et \(\sim -47 \; ^\circ{ \rm C}\) pour les cellules25). Ainsi, lorsqu'un système se refroidit, il traverse d'abord la "zone de croissance", mais pour l'instant il n'y a "rien à faire pousser" (pas encore de noyaux). Ce n'est qu'après que la zone de nucléation est atteinte et que de petits embryons de glace peuvent apparaître qui ne se développeront pas et ne sont donc pas létaux en principe. Enfin, le système se cristallise et il est stocké. Lorsqu'il est réchauffé, cependant, une recristallisation (voire une dévitrification) peut se produire26. Le réchauffement commence par traverser, et pour la seconde fois, la zone de haute nucléation, avec l'apparition possible de nouveaux embryons ; en effet, Boutron27 a souligné la présence de \({10}^{6}\) à \({10}^{12}\) fois plus de noyaux lors du réchauffement depuis l'état amorphe que lors du refroidissement depuis l'état liquide. Enfin, la zone de croissance est à nouveau traversée, où il y aura désormais un nombre considérable de noyaux opportunistes pouvant atteindre une taille mortelle. Ces cristaux, plus nombreux, comme on dit, lors du réchauffement, voient leur croissance favorisée à mesure que la température augmente28. Le moyen d'éviter cette croissance est de traverser cette zone très rapidement. C'est pourquoi un taux de réchauffement élevé est crucial et, dans un certain sens, plus important que le taux de refroidissement ; la pertinence du réchauffement a récemment été mise en évidence comme un changement de paradigme dans la cryoconservation24. Le lecteur intéressé pourra trouver dans la bibliographie une analyse approfondie et détaillée des thèmes développés dans ce paragraphe29.

Dans les systèmes cryoconservés par congélation lente, comme il s'agit de cette étude, par opposition à la vitrification, le problème de la recristallisation, et le besoin conséquent de taux de réchauffement élevés, a été systématiquement identifié dans toutes sortes de situations. Cela a conduit à la recommandation de taux de réchauffement élevés dans le cadre des bons processus de fabrication (BPF)30,31. Ainsi, il est bien connu comment, de cette manière, la recristallisation est évitée dans des échantillons allant de la taille des spermatozoïdes32 aux poches de sang30, voire des cryotubes en thérapie cellulaire33. Un cas d'intérêt a récemment été étudié dans le cadre de CAR-T34, où des études conjointes de cryomicroscopie et de calorimétrie ont identifié l'avantage de taux de réchauffement élevés pour éviter la recristallisation.

Afin d'atteindre des vitesses de réchauffement élevées, différentes formes d'application du champ électromagnétique ont été proposées compte tenu de sa capacité de pénétration et donc en principe évolutive. Cette application a été faite soit directement35,36,37,38 soit indirectement par l'intermédiaire d'un agent médiateur39,40,41. Des avancées importantes en la matière ont été réalisées récemment42. Un tableau comparant les différentes méthodes de chauffage volumétrique peut être trouvé dans les informations supplémentaires.

Une alternative au champ électromagnétique, également pénétrante43, sont les ultrasons focalisés à haute intensité (HIFU)44. L'origine de l'application de HIFU remonte à 192745, où l'on parlait déjà d'un domaine avec un large éventail de possibilités à explorer. 15 ans plus tard, les premières tumeurs étaient brûlées par la chaleur intense générée par ces ondes46. Cependant, il a fallu attendre le développement de la RMN47 pour que les techniques d'imagerie permettent un contrôle HIFU basé sur l'IRM-thermographie. De nos jours, il existe une large gamme de configurations IRM disponibles (séquences) qui permettent d'obtenir des images thermiques 3D pour de nombreux tissus dans différentes circonstances48. D'autre part, il convient de noter que l'atténuation et la pénétrabilité des ultrasons sont fonction de leur fréquence (par exemple, à 1 MHz, l'onde ultrasonore est atténuée d'environ 50 % lorsqu'elle se propage à travers 7 cm de tissus mous, et à 2 MHz l'onde est réduite à environ 25% de sa valeur initiale par le même tissu43). Par conséquent, pour les échantillons de grande taille, il est conseillé d'avoir un réseau de transducteurs, car cela améliore la pénétration effective des ondes et l'évolutivité en contrôlant les phases relatives de l'onde de chaque canal, en traitant les changements dans le biomatériau et les inhomogénéités (fractures, glace, …) en temps réel. Dans ce travail, nous avons utilisé un seul transducteur (échantillons de taille mm); dans les simulations informatiques précédentes, nous avons exploré vingt-six transducteurs (taille cm)44. Les dispositifs constitués de milliers de transducteurs sont courants de nos jours, permettant un chauffage avec une précision supérieure au dixième de degré dans une multitude de thérapies médicales49.

Notre groupe de recherche a récemment publié44,50 le résultat de simulations informatiques de HIFU pour le réchauffement en cryoconservation avec la promesse de le mettre en pratique dans le présent travail. Pour cela, nous avons utilisé le C. elegans comme preuve de principe. La cryoconservation conventionnelle de C. elegans23,51 est affectée par le problème de la recristallisation, maintenant des taux de récupération faibles dans les plus petits stades larvaires - L1 et L2 - (35%), et pratiquement nuls au stade adulte51. Cependant, si le réchauffement est rapide, cela ne se produit pas52. Dans les lignes suivantes nous montrons, pour la première fois, la présentation des HIFU pour éviter le problème de recristallisation à base de ce ver. Pour cela, des nématodes N2 ont été cultivés dans des conditions habituelles, à \(20\;\mathrm{^\circ{\rm C} }\). La population étant stabilisée après au moins 5 générations, le processus de cryoconservation a été effectué. Deux groupes étaient toujours constitués pour le réchauffement : un groupe témoin, réchauffé de manière standard23,51, et un groupe expérimental, réchauffé aux ultrasons. Les paragraphes suivants décrivent les défis techniques qui ont dû être surmontés, les détails des expériences réalisées et, enfin, les résultats obtenus.

Comme nous l'avons mentionné, avant de réaliser les expériences, une série de défis pratiques ont dû être relevés. Ainsi, un dispositif HIFU a été construit à partir d'un générateur d'ondes carrées utilisant quatre transistors de puissance avec leurs pilotes respectifs, un oscillateur à 1,22 MHz, un microcontrôleur et divers éléments passifs. Ce générateur d'ondes accepte une puissance de pont de transistor jusqu'à 200 W fournie par une source externe et fournit l'excitation au transducteur HIFU. Le transducteur HIFU est une calotte sphérique PTZ-8 d'un rayon de courbure de 50,8 mm et d'une profondeur de calotte de 10 mm qui est basée sur l'effet piézoélectrique pour convertir l'excitation électrique d'onde carrée en une oscillation mécanique, c'est-à-dire en ondes de pression, avec une amplitude proportionnelle à la racine carrée de la puissance utilisée. Le capuchon se trouve dans une chambre scellée, décrite sur la figure 2a. La fréquence de résonance du capuchon en céramique était de 1,5 MHz, bien qu'il ait été alimenté à une fréquence inférieure, comme on le voit dans la sortie du générateur illustrée à la Fig. 2b, pour surmonter le croisement possible dans les transistors du générateur. Le foyer où se concentrent les ultrasons, qui dépend de la forme et des dimensions du transducteur, a été déterminé indépendamment par trois méthodes différentes : par thermographie avec un bolomètre, par thermographie avec film thermosensible et avec des thermocouples. Les mesures visaient à déterminer la distance sur l'axe z à laquelle se situe le centre de la région focale. Pour obtenir des valeurs précises, les moteurs pas à pas d'une imprimante FDM CREALITY Ender 3-Pro ont été utilisés pour contrôler la position de la pointe du thermocouple, avec une précision de 100 µm. Les expériences thermiques réalisées à différentes distances de la surface de la calotte (voir Fig. S5) ont donné une position du foyer à 50,8 mm par rapport à celle-ci, point d'échauffement maximal. Ceci est en parfait accord avec ce qui est attendu selon la géométrie du transducteur détaillée ci-dessus.

Caractérisation de l'équipement Ultrasons Focalisés de Haute Intensité. (a) Section du transducteur HIFU. A–D : Châssis en PVC, pour assurer la structure, l'étanchéité et la chambre à air derrière le capuchon ; E : film conducteur pour la surface extérieure du capuchon ; F : film conducteur pour la surface intérieure du capuchon ; G : mastic époxy (externe et interne) ; H : câble coaxial d'alimentation ; J : chambre à air ; K : bouchon à bille en céramique PTZ-8 ; L : bouchon de vidange de la chambre à air en cas d'infiltration. (b) Sortie du générateur d'onde carrée, sans alimentation de la source externe. La fréquence du signal est de 1,22 MHz, avec une amplitude de 18 V crête à crête. ( c ) Courbes de température obtenues en chauffant avec HIFU à différentes tensions et courants de l'alimentation externe. Les clichés ont été normalisés pour 60 s d'exposition. Les taux de réchauffement obtenus dépendaient de l'alimentation de la source externe. La puissance nominale du piezo étant de 25W, un fonctionnement en dessous (cas de la courbe pour 20 V et 0,68 A) entraîne des performances réduites. (d) Détail de la région focale du chauffage par ultrasons. Le transfert de chaleur est le plus important dans une région ovoïde de dimensions 12 × 15 mm. Ces valeurs ont été obtenues à partir des expériences de thermographie avec film thermosensible, dont l'exemple est montré en (e). (e) Profil thermographique du chauffage avec HIFU dans l'eau à température ambiante. Le chauffage produit, dans la section, des cercles concentriques par rapport au foyer. Entre le point le plus chaud et le point le plus froid, une différence de température inférieure à \(10 \;^\circ{\rm C}\) est toujours enregistrée.

Avec différentes tensions (dans la plage de 20 à 60 V) et courants (dans la plage de 680 mA à 2,26 A) d'alimentation CC pour le générateur d'ondes, les courbes de chauffage reflétées dans la Fig. 2c ont été obtenues par le transducteur, en faisant varier la puissance d'alimentation. Les vitesses d'échauffement atteintes par l'appareil, aux différentes puissances d'alimentation, étaient comprises approximativement entre 14 et 218 \(^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Ensuite, la forme de la région focale a été caractérisée, comme le volume dans lequel à tout instant pendant le réchauffement, la différence de température maximale entre deux points quelconques était toujours inférieure à \(10 \; ^\circ{\rm C}\). Il en est résulté un ovoïde de dimensions 12,4 × 15,4 mm. Ces valeurs sont visibles sur les figures 2d et e.

Afin de garantir que toute la population de nématodes, trempée dans la solution cryoprotectrice, soit confinée dans le foyer ultrasonore, il a fallu les cryoconserver dans un petit contenant spécialement conçu. Ledit conteneur consistait en un puits creux, construit à l'intérieur d'une boîte de Pétri, utilisant de l'agar comme charge pour le reste. Son détail est illustré à la Fig. 3d. Les dimensions du puits ont été fixées à 9 mm de diamètre sur 6 mm de profondeur, soit moins que les dimensions de l'ovoïde focal. Pour s'assurer de l'absence de fuite du milieu cryoprotecteur à travers la gélose, les parois du puits ont été recouvertes d'un film d'alcool isopropylique. L'efficacité du traitement a été confirmée par des expériences de perméabilité de ces puits, révélées par le passage -ou non- de rouge de phénol, en tant que coloration, à travers la gélose. Ces puits sur mesure servent simplement de conteneur de confinement adapté à notre géométrie ; des matériaux et des formes alternatifs peuvent également être utilisés, tant qu'ils sont capables de transmettre des ultrasons. Enfin, avant refroidissement, les plaques étaient toujours fermées avec leur couvercle et scellées avec du parafilm. Cela permet l'utilisation de notre technologie conformément aux BPF, car l'échantillon est isolé. Pour le réchauffement par ultrasons, l'éthylène glycol a été choisi comme milieu liquide pour la transmission des ondes sonores du transducteur à l'échantillon. Ce milieu peut maintenir les nématodes initialement à − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) en restant à l'état liquide même à des températures suffisamment basses.

Histoire thermique pour la cryoconservation de C. elegans et montage expérimental. (a) Courbes de température lors du processus de congélation lente, du stockage à \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) (représenté par le "gap" sur le graphique) et de la récupération par chauffage HIFU. Les échantillons commencent à température ambiante et, après incubation dans une solution cryoprotectrice pendant 10 min, ils sont placés au congélateur à \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) pour un refroidissement à \(- 0,6 \; ^ \circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Ensuite, ils sont stockés pendant 48 h et récupérés par chauffage aux ultrasons directement à partir de la température de stockage, jusqu'à une température d'environ \(-5 \; ^\circ{\rm C}\). (b) Montage expérimental montrant A : bain d'éthylène glycol à \(-70 \ ; ^\circ{\rm C}\ ); B : transducteur HIFU ; C : support de plaque en PLA ; D : boîte de Pétri (avec puits en son centre) couverte, scellée avec du parafilm et inversée ; E : thermomètre externe ; F : générateur d'ondes carrées ; G : alimentation externe. (c) Vue en coupe 3D de la configuration expérimentale, modélisée en CAO. Dans cette image, la fonction du support et son utilisation sont mieux appréciées. Les balises sont partagées avec l'image (b). (d) Détail du puits d'agar dans une boîte de Petri de 50 mm de diamètre. La plaque est présentée inversée, c'est ainsi qu'elle est posée sur le support 3D pour être exposée aux ultrasons.

L'immersion nécessaire du transducteur HIFU par sa partie concave dans le bain générait fréquemment une bulle d'air indésirable. Ceux-ci ont été éliminés au moyen d'un suceur de gaz immergé dans l'éthylène glycol. Enfin, la répétabilité des expériences et la stabilité de la position du foyer par rapport à l'échantillon chauffé ont été garanties avec la construction d'un support en acide polylactique (PLA) imprimé en 3D qui abrite et immobilise solidement la boîte de Pétri et le transducteur, fabriqués avec les techniques CAD et FDM. Les figures 3b et c montrent la configuration expérimentale pour l'utilisation de HIFU avec les plaques fabriquées. Des détails sur les modes de panne et la praticité du chauffage peuvent être trouvés dans les informations complémentaires.

Les performances physiques de l'ensemble de la configuration décrite ci-dessus ont été modélisées par calcul à l'aide d'éléments finis (Comsol Multiphysics v6.7), en utilisant ensemble les packages Acoustics et Heat Transfer. Le résultat de ces simulations informatiques a corroboré à la fois la position du foyer et ses dimensions, ainsi que les taux de réchauffement trouvés expérimentalement. Les champs de pression acoustique et de température dans une vue 2D de l'expérience sont affichés sur les Fig. 4e et f, respectivement. La figure S10 donne un aperçu des contours isothermes lors d'une simulation de réchauffement de 60 s.

Présentation des résultats. ( a ) Survie avec HIFU en fonction du taux de réchauffement et du temps d'exposition. Les faibles taux de réchauffement montrent de moins bons résultats dans la récupération de C. elegans. Les expériences ont toujours été faites avec des boîtes contenant des groupes de nématodes \(\sim 200\). Celles-ci présentaient la composition moyenne suivante : 20 % d'individus en stade L1, 30 % en L2, 25 % en L3, 15 % en L4 et 10 % d'adultes. Pour les paramètres optimaux, la survie par stade de croissance n'était pas homogène, car plus de nématodes L1–L3 ont été récupérés que de L4 et d'adultes. La survie en L4 était de 70 %. La survie des adultes était comprise entre 40 et 60 %. (b) et (c) Montrent la survie pour les taux de réchauffement les plus élevés, \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) et \(217,8 \;^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) , en fonction du temps d'exposition. Des temps d'exposition courts (moins de 50 s) et excessivement longs (plus de 70 s) ont entraîné des taux de survie très faibles. (d) Dépendance de la vitesse de réchauffement pour le temps d'exposition optimal. Pour les faibles taux de réchauffement, le taux de récupération est proche de 0 %, atteignant 90 % pour les taux de réchauffement les plus élevés. Ces résultats sont à rapprocher du protocole du Brenner, avec seulement 35 % pour les stades les plus favorables (L1–L2) et proche de 0 % pour les adultes. La ligne pointillée n'est pas une interpolation des résultats, mais une ligne de tendance. (e) Simulation par éléments finis de la pression acoustique dans une section 2D de l'expérience. La région de pression acoustique la plus élevée, 270 dB, est atteinte au foyer géométrique du transducteur. (f) Simulation par éléments finis du champ de température. dans une coupe 2D de l'expérience, après 60 s d'exposition aux HIFU. La température la plus élevée est atteinte au foyer. La boîte de Pétri est placée à l'envers, le rectangle noir représentant le puits contenant les vers, pour éviter tout vide d'air entre les ultrasons et les nématodes. (g) Nématode mort après un réchauffement insuffisamment rapide (\(<150 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)). (h) Nématodes quelques heures après avoir été récupérés par chauffage HIFU. Toutes les étapes de croissance sont appréciées. (i) Oeuf de C. elegans après récupération des nématodes : leur capacité de reproduction est préservée après cryoconservation et réchauffement HIFU.

Après avoir surmonté tous les détails et vérifications précédents, nous sommes passés à la phase expérimentale avec C. elegans. Pour cela, les nématodes ont été cryoconservés selon le protocole standard du Brenner53 en utilisant une congélation lente dans du glycérol à 15%, adapté à nos besoins. Des populations d'environ 200 individus de tous les stades de croissance ont été refroidies à −\(0,6 \; ^\circ{\rm C} /min\), jusqu'à − \(80 \; ^\circ{\rm C}\), dans les puits construits dans les boîtes de Petri décrites ci-dessus. La quantité de glace formée dans ce système est discutée dans les informations supplémentaires. Après 48 h de stockage à − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) les nématodes ont été réchauffés. Pour chaque expérience, il y avait toujours deux plaques. La première plaque a été réchauffée aux ultrasons, en les appliquant jusqu'à ce que la température du puits avec les nématodes atteigne environ − \(5 \; ^\circ{\rm C}\) (température supérieure au point de fusion de la solution). L'évolution de la température tout au long du processus est représentée sur la figure 3a. La seconde plaque a été réchauffée de manière classique : soit en la laissant à l'air (taux de réchauffement : \(\sim 10 \; ^\circ{\rm C}\)/min) jusqu'à ce que la solution avec les nématodes soit complètement décongelée , ou en l'immergeant dans un bain-marie à \(37 \; ^\circ{\rm C}\) (vitesse de réchauffement : \(\sim 93 \; ^\circ{\rm C}\)/min) pendant 1 minute. Après réchauffement, les vers ont été placés sur une assiette avec de la nourriture. Enfin, la récupération de ceux-ci a été observée en analysant leur mobilité immédiatement après leur dépôt, leur mobilité après 24h, et leur capacité de reproduction.

Au total, 53 expériences HIFU impliquant plus de 10 000 nématodes ont été réalisées. Le tableau affiché sur la figure 4a montre le taux de survie en fonction du taux de réchauffement et du temps d'exposition aux ultrasons. Tous les taux de réchauffement de la Fig. 4 ont été mesurés dans l'intervalle de − \(60\) à − \(40 \; ^\circ{\rm C}\). Cet intervalle a été choisi car c'est la zone dans laquelle le problème de recristallisation peut être le plus critique43,54.

Le transducteur ultrasonore était alimenté par quatre puissances différentes : 13,6 W, 33,9 W, 90,5 W et 134,4 W. Une partie de cette énergie était dissipée dans l'électronique. Les taux de réchauffement associés, mesurés par des thermocouples, étaient \(14,2 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), \(31,7 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min }\), \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) et \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), respectivement. Des vitesses plus élevées n'ont pas pu être explorées car ce dernier est le maximum réalisable par notre système actuel.

Avant les résultats présentés ci-dessous, une série d'expériences préliminaires et exploratoires ont été menées, déterminant la preuve de l'avantage de taux de réchauffement élevés. Pour cette raison, les taux de réchauffement plus élevés ont ensuite été étudiés plus en détail : \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) et \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Pour eux, un spectre de temps d'exposition a été exploré : 30 s, 40 s, 50 s, 60 s, 70 s et 80 s pour \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /min\) et 40 s, 50 s, 60 s, 70 s, 80 s et 90 s pour \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Les résultats de ces expériences sont présentés sur les figures 4b et c. Dans les deux cas, on observe qu'un temps d'exposition insuffisant ou excessif aux HIFU a été fatal pour la population étudiée.

Sur la Fig. 4b, correspondant à un taux de réchauffement de \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), nous pouvons voir que pour des expositions inférieures à 30 s, 40 s et 50 s, le taux de récupération est de 0 %. Elle monte pendant 60 s, et atteint un maximum en 70 s, redescend pour des temps d'exposition plus longs, atteignant finalement 0 % (non représenté).

De même, sur la Fig. 4c, correspondant à un taux de réchauffement de \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), pour des expositions inférieures à 40 s, le taux de récupération est de 0 %. Lorsque le temps d'exposition augmente à 40 s, 50 s et 60 s, le taux de récupération augmente progressivement, atteignant un maximum pendant 70 s. A partir de cette valeur du temps d'exposition, le taux de récupération redescend jusqu'à devenir nul.

Enfin, sur la figure 4d, la survie est tracée en fonction du taux de réchauffement pour les temps d'exposition optimaux trouvés précédemment. Ce graphique montre comment le taux de survie commence à pratiquement 0 % pour les taux de réchauffement les plus bas, monte à 20 % pour les taux de réchauffement intermédiaires (\(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)) et atteint finalement 90 % pour les taux de réchauffement les plus élevés (\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)).

Concernant les adultes, pour la configuration optimale, \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) et un temps d'exposition de 70 s, il y avait 3 plaques. Dans chacune d'elles, comme dans le reste des plaques de cette étude, il y avait environ 200 vers, dont environ 20 adultes. Après l'application de l'échographie, 7 adultes ont été retrouvés dans le pire des cas et 10 dans le meilleur d'entre eux, représentant un taux de survie entre 40 et 50 % pour les adultes, respectivement. Des vidéos des vers adultes récupérés peuvent être vues dans les informations supplémentaires (Fig. S11). Rappelons que le taux de récupération adulte est proche de 0% pour un réchauffement lent classique.

Les figures 4g–i montrent, respectivement, un détail d'un nématode tué par un taux de réchauffement insuffisant, un groupe de nématodes de tous âges après réchauffement à \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\ ) pendant 70 s, et un œuf pondu brièvement après la récupération du nématode.

Pour être complet, les deux formes de réchauffement standard, dans un bain à \(37 \; ^\circ{\rm C}\) et à l'air (température ambiante : \(25 \; ^\circ{\rm C} \)), ont également été enregistrés. Dans le bain-marie, la survie était de 0 %, ce qui concorde avec les conclusions de Brenner23 (voir Informations supplémentaires pour une discussion de ce résultat). Pour l'air, la récupération était d'environ 35 % pour L1–L2 et proche de 0 % pour les adultes, également en accord avec nos études récentes51.

Nous pouvons conclure que ces observations prouvent, pour la première fois, la capacité des HIFU à atteindre les vitesses de réchauffement nécessaires pour éviter le problème de la recristallisation en cryoconservation. Les avantages de cette technologie sont multiples : (1) elle ne génère pas de motifs stationnaires comme les micro-ondes, (2) elle ne présente pas le problème d'emballement thermique, (3) elle peut être utilisée pour des échantillons déjà stockés avec des cryoprotecteurs conventionnels, (4) il est contrôlable en temps réel par IRM, (5) est facilement contrôlable par interférométrie, (6) est couramment utilisé dans de nombreux autres domaines, ce qui représente un grand intérêt, et surtout (7) est évolutif. Tout cela fait de cette approche un outil prometteur, seul ou en conjonction avec d'autres technologies émergentes telles que le nano-réchauffement39. Les prochaines étapes possibles consistent à augmenter le nombre de transducteurs, à les utiliser conjointement avec la tomographie par ordinateur à rayons X pour surveiller le champ CPA/la glace/les fractures et à s'appliquer aux systèmes qui ont déjà montré un certain degré de succès.

C. elegans a été utilisé comme modèle animal. Nous pensons qu'il s'agit d'un système idéal, disposant d'un ensemble complet d'organes, étant à la base de développements importants en génétique, biologie du développement, neurosciences ou oncologie, et un outil de travail pour plus de 500 laboratoires à travers le monde. L'utilisation du ver ici est uniquement une preuve de principe; cependant, même ainsi, il peut être intéressant en soi pour la conservation de l'état adulte, pour des souches qui congèlent mal ou pour des structures de tailles similaires comme l'embryon de Drosophile55. Dans tous les cas, notre technique aide dans toutes les situations où le problème omniprésent de la recristallisation peut apparaître, y compris la cryoconservation des organes. De son application dans ce domaine, nous attendons un changement de paradigme et de nouvelles voies vers la banque d'organes et de tissus.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche a été partiellement financée par les subventions : Plan Propio de Investigacion de la Universidad de Sevilla et Ministère de la science et de la technologie (Espagne), AICIA, PEJUS-89 et EQC2019-005949. Nous remercions Juan Jose Jimenez pour son travail avec l'électronique. Nous remercions également les relecteurs anonymes qui contribuent à améliorer la qualité de ce manuscrit.

École supérieure d'ingénierie, C/Camino de los Descubrimientos s/n, Université de Séville, 41092, Séville, Espagne

Enrique Alcalá, Laura Encabo, Fatima Barroso, Adriana Puentes et Ramon Risco

SafePreservation, C/Avda. De la Ciencias 55, 41020, Séville, Espagne

Isabelle Risco

National Accelerators Centre-US, JA, CSIC, C/Tomas Alva Edison 7, 41092, Séville, Espagne

Ramon Risco

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RR et IR ont conçu l'idée de HIFU pour éviter la recristallisation ; EA et LE ont effectué le processus de refroidissement ; EA et AP ont fait le tournage avec l'échographie ; LE et FB entretenaient les vers ; EA a réalisé les conceptions 3D ; EA et AP ont déterminé la mise au point ; EA a réalisé les simulations informatiques. LE et FB ont préparé les solutions ; EA et LE ont fabriqué les plaques de gélose spéciales ; EA a réalisé l'analyse statistique ; EA, LE, IR et RR ont rédigé l'article ; EA, LE, IR et RR en ont fait une lecture critique ; RR dirigeait l'équipe.

Correspondance à Ramon Risco.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Figure supplémentaire 10.

Figure supplémentaire 11.

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Réimpressions et autorisations

Alcalá, E., Encabo, L., Barroso, F. et al. Ondes sonores pour résoudre le problème de la recristallisation en cryoconservation. Sci Rep 13, 7603 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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Reçu : 20 décembre 2022

Accepté : 05 mai 2023

Publié: 10 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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